La doctrine du Saint-Esprit est l'élément le plus distinctif de la théologie des Assemblées de Dieu. Les Assemblées affirment que le Saint-Esprit est la troisième personne de la Trinité, pleinement divin et coégal avec le Père et le Fils. L'Esprit convainc de péché, régénère le croyant, habite en chaque chrétien, et distribue les dons spirituels. Cependant, les Assemblées vont plus loin que la plupart des églises évangéliques en enseignant une expérience distincte appelée « le baptême du Saint-Esprit ».

La théologie des Assemblées soutient que le baptême du Saint-Esprit est une deuxième œuvre définie de la grâce, ultérieure à la conversion, qui revêt le croyant de puissance pour le témoignage et le ministère chrétien. Tirant sur Actes 2 (Pentecôte) et des passages apparentés, les Assemblées enseignent que la preuve physique initiale de ce baptême dans l'Esprit est la parole en d'autres langues (glossolalie) — une énonciation surnaturelle dans une langue non apprise. Cette doctrine de la « preuve initiale » distingue les Assemblées des autres groupes évangéliques et charismatiques.

Au-delà des langues comme preuve initiale, les Assemblées affirment l'opération continuelle de tous les dons spirituels énumérés dans 1 Corinthiens 12, y compris la prophétie, la guérison, les miracles, et les paroles de connaissance. Ces dons sont disponibles à l'église aujourd'hui et sont exercés régulièrement dans l'adoration des Assemblées. Les Assemblées sont explicitement non-cessationnistes, rejetant la vue que les dons miraculeux ont cessé après l'époque apostolique.